MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

Métodos Laboratoriais que Utilizam Anticorpos

1. INTRODUÇÃO

1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:

*Especificidade;

*Diversidade;

*Memória;

*Especialização;

*Autolimitação;

*Não reatividade ao próprio;

Especificidade – conferida por duas moléculas principais:

- TCR – presente na membrana de linfócitos;
- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.
     Principais isotipos de anticorpos

     *IgM;

     *IgG;
     *IgA;
     *IgE;
     *IgD.

1.2. Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:

*Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado.

*Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.

*Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.

*Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada

*Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac.

*Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

1.3. Fatores a serem analisados na escolha do método:

*Sensibilidade;

*Especificidade (confiabilidade de resultados);

*Custo;

*Disponibilidade de material;

*Segurança;

*Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada;

*Tempo de realização do método.

1.4. Aplicações dos métodos:
*Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos;

*Purificação de proteínas;

*Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades;

*Identificação de genes e seus produtos;

*Localização de moléculas específicas em células e tecidos.

2. PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.1. - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros testes a serem desenvolvidos:

*Realizados em meio líquido;

*Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade;

*Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.

2.2- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar).

Diversos tipos:

*Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente;

*Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

*Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado.

*Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas. Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais.

2.3.Hemoaglutinação
– Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos.

- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac;

- Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação.

- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido;

- Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica

- Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos.

-  Métodos de alta especificidade e alta especificidade

- Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).

-          Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular.

-          Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

2.7- Western-Blot

-  Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas

-           Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido

-           Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos

-           Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.

-          Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;

-           Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.